Ti6Al4V合金因具有優(yōu)異的力學和生物學特征而在骨植入物和骨組織修復領域備受關注 [1] 。但是，Ti6Al4V合金材料導熱系數(shù)小，彈性模量低，這使得傳統(tǒng)制造技術難以滿足復雜Ti6Al4V合金精密零件的制作要求 [2] 。隨著先進成型技術的快速發(fā)展，增材制造技術為上述問題提供了理想的解決途徑。激光粉末床融合技術（Laser Powder Bed Fusion, LPBF）具有加工分辨率高、設計靈活、成形穩(wěn)定、結果可預測等特點，是目前制造金屬部件最普遍采用的增材制造技術，能實現(xiàn)復雜多孔金屬材料的制備，可為患者提供“量體裁衣”式的骨科治療方案 [3] 。

鈦合金骨植入物的生物惰性是限制其臨床應用的主要因素 [4] ，因此應對其表面進行改性處理，以提高其生物活性，促進植入物與天然骨組織形成充分的骨整合 [5] 。鈦表面形貌可以通過多種改性方法改善 [5-10] ，目前廣泛采用的方法大致分為：物理處理法、化學處理法和生物處理法。其中，化學處理法操作簡單，易在材料表面形成均勻涂層，結構和成分與自然骨相似，并且對于多孔結構而言，化學處理可使涂層均勻覆蓋在復雜孔洞表面，是一種最適用的表面處理方法 [11] 。化學處理方法又包括酸蝕處理、堿熱處理、陽極氧化、微弧氧化等，是目前的研究熱點。本研究選用了經濟有效的堿熱處理方法，經堿熱處理后多孔鈦表面生成了一層具有生物活性的物質，再誘導類骨羥基磷灰石沉積，提高了惰性生物材料的生物活性，并且不損害材料本身的良好性能 [4,12-14] 。但是，以往的研究表明，在堿熱處理過程中，材料表面的鈦酸鈉納米線易聚集為片狀，分布不均且易產生裂紋，降低了表面改性產生的生物活化效率，這對后續(xù)羥基磷灰石沉積、細胞的粘附和增殖都將產生不良影響 [15] ，甚至會影響材料的整體力學性能。因此，探究合適的堿熱處理參數(shù)是提高經表面處理后材料生物活化效率的關鍵。

本研究通過優(yōu)化堿熱處理的工藝參數(shù)，在Ti6Al4V多孔鈦合金表面成功制備了分布均勻、大小適中且無裂紋的網(wǎng)狀納米結構涂層，并對此活化層的成分進行了分析；將表面改性后的樣品經模擬體液浸泡，使其表面形成多層次的納米結構涂層，并對樣品進行體外細胞實驗，考察其對成骨細胞粘附、增殖和分化過程的影響。

1 、實驗部分

1.1 樣品設計與制備

多孔鈦合金的單元結構特征和孔隙率參數(shù)是調節(jié)其力學和生物學性能的關鍵因素 [16] 。

因六方金剛石結構具有強度高、穩(wěn)定性強等性能特點 [17] ，在3-matic（Materialise）軟件中，以六方金剛石結構為基本重復單元，設計了小梁直徑為0.37 mm，孔隙率為70%的TiS圓柱（Φ 6 mm × 10 mm），模擬松質骨的孔隙度及幾何形狀特征。以Ti6Al4V合金粉末（粒徑15~53 μm）為原料，利用LPBF技術制備上述設計尺寸的Ti6Al4V多孔鈦合金試樣。打印參數(shù)：激光功率150 W，掃描速度1250 mm/s，鋪粉厚度0.03 mm，掃描間距0.05 mm。經準靜態(tài)壓縮實驗測試得知，所制備的多孔鈦合金樣品的彈性模量為2.815 GPa，抗壓強度為95.008 MPa，可滿足人骨對骨替換材料的力學要求。

1.2 表面處理與細胞活性測試

分別配制3 mol/L和7 mol/L的NaOH溶液，備用。燒杯中加入適量37% HCl溶液，將試樣完全浸潤其中，在水浴條件下50 ℃保溫60 min后取出，用大量去離子水和乙醇溶液超聲清洗、烘干。將試樣分別放入離心管中，加入適量3 mol/L或7 mol/L的NaOH溶液，水浴條件下60 ℃保溫1、4和10 h，具體實驗參數(shù)見表1。試樣取出后，用大量去離子水和乙醇溶液超聲清洗、烘干。最后，將試樣放入臥式爐中，通氬氣保護，在600 ℃下保溫30min，隨爐降溫后取出。采用掃描電子顯微鏡（SEM）和能量色散X射線光譜（EDS）表征樣品。另外，為了表征涂層，采用線切割將試樣軸向切開，使用SEM和EDS分析切面涂層。

選用最佳堿熱處理參數(shù)對樣品進行表面改性處理后，將樣品在37 ℃恒溫條件下置于模擬體液（SBF）中浸泡10 d（每48 h更換1次SBF），SBF成分如表1所示。取出浸泡后的試樣，放入烘干箱內70 ℃烘干24 h以上。為方便區(qū)分，對不同方式處理的試樣分別命名：將六方金剛石結構多孔鈦合金材料命名為TiS，將經過堿熱處理的六方金剛石結構多孔鈦合金材料命名為TiS-A，將經過堿熱處理并在模擬體液中浸泡10 d的六方金剛石結構多孔鈦合金材料命名為TiS-A SBF采用TiS、TiS-A和TiS-A SBF 這3組樣品，每組準備3件試樣進行細胞培養(yǎng)實驗。由于所設計的植入物主要針對骨創(chuàng)傷或疾病引起的骨缺損，因此選擇骨髓間充質干細胞（hBMSC）采用直接接觸的方式培養(yǎng)到樣品上。

按照iCell原代間充質干細胞無血清培養(yǎng)體系（PriMed-iCell-012-SF）配制，hBMSC細胞在5% CO₂ 、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分為Control組和待測樣品組，其中，Control組每孔加入1000 μL 細胞懸液；待測樣品組先加入經過121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌處理20 min后的樣品，再在每孔加入1000 μL細胞懸液。每個處理組均做3個復孔。取對數(shù)生長期的hBMSC細胞進行細胞計數(shù)，調整細胞濃度，采用直接接觸的方式，將hBMSC在48孔板鈦合金材料上接種2 × 10 4 個細胞，在5% CO₂、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗各孔3次，每孔加入1000 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基，再放入5% CO₂、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。最后采用酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。

細胞經48 h培養(yǎng)后，采用活細胞/死細胞染色試劑盒對樣品進行染色，評估細胞存活力：熒光染料鈣黃綠素（Calcein-AM）染色活細胞呈綠色，熒光染料PI（碘化丙啶）染色死細胞呈紅色。采用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察染色樣品。

2、 結果與討論

2.1 鈦合金表面處理后的微觀組織表征

酸蝕預處理能夠去除鈦合金表面的污染物和氧化層。堿熱處理過程中，通過HTiO₃^- 和HTiO ₃ ‒ •nH ₂ O吸引Na ⁺ 在表面生成網(wǎng)狀的鈦酸鈉凝膠層，再經高溫燒結，表面脫水形成鈦酸鈉。采用不同的實驗參數(shù)對鈦合金表面進行處理后，以電鏡觀察其微觀組織。如圖1所示，采用不同參數(shù)對鈦合金表面改性后，試樣表面均形成了納米線結構，并且未產生裂紋。當采用3 mol/L NaOH溶液時，在短時間內鈦合金表面呈現(xiàn)納米網(wǎng)狀結構，隨著時間延長，納米線直徑變粗并呈現(xiàn)團簇狀；NaOH濃度增至7 mol/L有利于鈦酸鈉納米線迅速生長及密度增大，隨著時間延長，鈦合金表面聚集為納米片狀結構，中心容易形成大的孔洞，分布不均勻。

對鈦合金表面形貌進行能譜分析，以 7 mol/L NaOH 溶液 60 ℃保溫 1 h 的處理方式為例，如圖 2 所示，試樣表面主要元素為 Na、O、Ti、Al、V。切割樣品對涂層進行電鏡觀察（圖 3），可見 Al和 V元素分布在整個涂層中并呈現(xiàn)出微小的波動，在邊界處 O元素出現(xiàn)明顯聚集。

綜上可知，采用高濃度堿溶液經短時間保溫處理的鈦合金試樣具有網(wǎng)狀結構有序、大小適中且分布均勻的表面形貌，可以為羥基磷灰石沉淀提供成核位點，促進細胞代謝過程的營養(yǎng)和氧氣交換，并為骨長入和骨整合提供適當?shù)目臻g [18] 。本研究表明多孔鈦合金經過酸洗預處理，用 7 mol/L NaOH溶液在 60 ℃下保溫 1 h 后，再經 600 ℃燒結 30 min 為最佳表面改性工藝，模擬體液浸泡實驗在此工藝下進行。

經過最佳表面改性工藝處理后，試樣經SBF培養(yǎng)10d，表面出現(xiàn)羥基磷灰石沉積涂層及白色花狀沉淀，如圖 4所示。

在模擬體液浸泡過程中，堿處理后鈦合金表面的 Na + 與 H ₃ O ⁺ 進行離子交換，使得鈦合金表面 pH 值增加，提高了 Ca ²⁺ 和 PO₄3‒ 活性，從而促進了磷灰石的形核；鈦合金表面形成了 Ti‒OH 官能團，能夠吸引模擬體液中的 Ca ²⁺ ，提高鈦和鈦合金表面的 Ca ²⁺ 和 PO₄3‒ 的過飽和度。堿處理后，鈦合金表面呈多孔網(wǎng)絡結構，TiO₂的密度增加，為磷灰石提供了優(yōu)越的異質形核位置，促使磷灰石從模擬體液中快速沉積出來而形成羥基磷灰石涂層。

2.2 多孔Ti6Al4V合金材料的生物學性能

為了評價多孔 Ti6Al4V 合金材料的生物相容性，從細胞形態(tài)和細胞相對活性兩個方面進行了考察。

采用直接接觸的方式將骨髓間充質干細胞在 TiS 上培養(yǎng) 48 h后的 CLSM結果如圖 5所示，Calcein-AM 可將活細胞染色而呈綠色、PI 可將死細胞染色而呈紅色（PI 染劑會被基體材料吸附）。實驗結果表明，經 48 h 培養(yǎng)后，實驗組與對照組的細胞均存活良好，僅有少量細胞死亡。相對于對照組細胞，實驗組細胞均勻分布在基體上，密度較高，但 Ti6Al4V合金材料的孔隙中不存在細胞，顯示出良好的貼壁細胞生長狀態(tài)。

在體外細胞培養(yǎng)過程中，鈦酸鈉納米線網(wǎng)狀結構可促進初始細胞粘附和營養(yǎng)供應，有利于早期骨再生。堿處理后的多孔 Ti6Al4V 合金經過模擬體液浸泡后，表面形成的磷灰石層是一種典型的生物活性材料，可與周圍骨組織發(fā)生化學鍵合，進一步提高其生物活性。

CCK8測試法是一種可用于細胞增殖和毒性分析等方面的生物測試方法。本研究采用CCK-8測定法評估細胞增殖。根據(jù)式（1）計算各組實驗試樣的細胞相對活性(Cell Vitality)。

式（1）中：OD e 為實驗組 OD 值，OD b 為背景 OD 值，OD c 為對照組 OD 值，OD = lg（1/trans）。其中，OD b 為多孔板本身（未加培養(yǎng)基和細胞的孔）的吸光度。

由圖 6 可見，TiS、TiS-A、TiS-A SBF 的細胞相對活力分別為 50.91%、52.47%、58.53%，Ti6Al4V 合金具有優(yōu)良的生物相容性，表面改性處理生成了鈦酸鈉納米線層，有助于提高材料生物活性；表面再經模擬體液浸泡，生物活性進一步提高，細胞相對活性由未處理前的 50.91%提高至 58.53%。

在體外細胞培養(yǎng)過程中，鈦酸鈉納米線網(wǎng)狀結構可促進初始細胞粘附和營養(yǎng)供應，有利于早期骨再生。堿處理后的多孔 Ti6Al4V 合金經過模擬體液浸泡后，表面形成的磷灰石層是一種典型的生物活性材料，可與周圍骨組織發(fā)生化學鍵合，進一步提高其生物活性。

3、 結論

對多孔 Ti6Al4V 合金的最佳堿熱處理工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，并通過體外細胞培養(yǎng)實驗驗證了 TiS、TiS-A、TiS-A SBF 的生物學性能，得到如下結論：

1）堿熱處理過程采用較低濃度堿溶液時，鈦合金表面在短時間內呈現(xiàn)納米網(wǎng)狀結構，隨著時間延長，納米線直徑變粗呈現(xiàn)團簇狀；采用較高濃度堿溶液時，有利于鈦酸鈉納米線迅速生長及密度增大，隨著時間延長，鈦酸鈉納米線聚集為納米片狀結構，中心容易形成大的孔洞，分布不均勻。

2）多孔 Ti6Al4V 合金本身具較好的生物學性能，經堿熱處理后，表面形成鈦酸鈉納米線涂層，細胞相對活性由 50.91%提高至 52.47%；再將堿熱處理后的 Ti6Al4V 合金材料浸入 SBF 溶液中浸泡 10 d，表面會生成磷灰石涂層，此時的細胞相對活性提高至 58.53%。

參考文獻：

[1] LIMMAHAKHUN S, OLOYEDE A, SITTHISERIPRATIP K, et al. 3D-printed cellular structures for bone biomimetic implants[J].Additive Manufacturing, 2017, 15: 93-101.

[2] WANG F Z, ZHAO J, ZHU N B. Constitutive equations and ANN approach to predict the flow stress of Ti-6Al-4V alloy based onABI tests[J]. Journal of Materials Engineering and Performance, 2016, 25(11): 4875-4884.

[3] DEPBOYLU F N, YASA E, POYRAZ Ö, et al. Titanium based bone implants production using laser powder bed fusion technology[J]. Journal of Materials Research and Technology, 2022, 17: 1408-1426.

[4] UMEHARA H, KOBATAKE R, DOI K, et al. Histological and bone morphometric evaluation of osseointegration aspects by alkali hydrothermally-treated implants[J]. Applied Sciences, 2018, 8(4): 635.

[5] LE GUÉHENNEC L, SOUEIDAN A, LAYROLLE P, et al. Surface treatments of titanium dental implants for rapid osseointegration[J]. Dental Materials, 2007, 23(7): 844-854.

[6] IWAYA Y, MACHIGASHIRA M, KANBARA K, et al. Surface properties and biocompatibility of acid-etched titanium[J]. Dental Materials Journal, 2008, 27(3): 415-421.

[7] HAMOUDA IBRAHIM M, ENAN ENAS T, AL-WAKEEL ESSAM E, et al. Alkali and heat treatment of titanium implant material for bioactivity[J]. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants, 2012, 27(4): 776-784.

[8] SHI X L, NAKAGAWA M, KAWACHI G, et al. Surface modification of titanium by hydrothermal treatment in Mg-containing  solution and early osteoblast responses[J]. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 2012, 23(5): 1281-1290.

[9] JEMAT A, GHAZALI M J, RAZALI M, et al. Surface modifications and their effects on titanium dental implants[J]. BioMed Research International, 2015, 2015: 791725.

[10] OFFERMANNS V, ANDERSEN O Z, RIEDE G, et al. Effect of strontium surface-functionalized implants on early and late osseointegration: a histological, spectrometric and tomographic evaluation[J]. Acta Biomaterialia, 2018, 69: 385-394.

[11] 王曉花, 李金山, 胡銳, 等. 多孔鈦表面無裂紋生物活化層的制備及表征[J]. 稀有金屬材料與工程, 2014, 43(6): 1392-1396.

[12] KOKUBO T, MIYAJI F, KIM H M, et al. Spontaneous formation of bonelike apatite layer on chemically treated titanium metals[J].Journal of the American Ceramic Society, 1996, 79(4): 1127-1129.

[13] BAN S, IWAYA Y, KONO H, et al. Surface modification of titanium by etching in concentrated sulfuric acid[J]. Dental Materials,2006, 22(12): 1115-1120.

[14] KONO H, MIYAMOTO M, BAN S. Bioactive apatite coating on titanium using an alternate soaking process[J]. Dental Materials Journal, 2007, 26(2): 186-193.

[15] HO W F, LAI C H, HSU H C, et al. Surface modification of a low-modulus Ti-7.5Mo alloy treated with aqueous NaOH[J]. Surface and Coatings Technology, 2009, 203(20/21): 3142-3150.

[16] WANG H, SU K X, SU L Z, et al. The effect of 3D-printed Ti 6 Al 4 V scaffolds with various macropore structures on osteointegration and osteogenesis: a biomechanical evaluation[J]. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials, 2018, 88: 488-496.

[17] WANG Y, ZENG Q F, DU X K, et al. The structural, mechanical and electronic properties of novel superhard carbon allotropes: ab initio study[J]. Materials Today Communications, 2021, 29: 102980.

[18] SHAHRIYARI F, RAZAGHIAN A, TAGHIABADI R, et al. Effect of friction hardening pre-treatment on increasing cytocompatibility of alkali heat-treated Ti-6Al-4V alloy[J]. Surface and Coatings Technology, 2018, 353: 148-157.

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